為什麼多數吸煙者不患肺癌？

眾所周知，肺癌與吸煙密切相關，香煙煙霧中的化學致癌物，如多環芳烴（PAHs），會引起 DNA 損傷，導致致癌突變。

但是據報道，70% 的吸煙相關死亡發生在老年人中，80-90% 的終身吸煙者從未患肺癌，也就是說約 10%-20% 的終身吸煙者患肺癌。

那麼為什麼會出現這樣的結果呢？或許從分子和遺傳機制的角度解釋這些觀察結果更有說服力，但目前仍然缺乏全面的分子風險評估研究。

因此，阿爾伯特 · 愛因斯坦醫學院 Jan Vijg、Simon D Spivack 和 Zhenqiu Huang 領銜的研究團隊，針對這個難題做瞭進一步研究。他們利用單細胞多重位移擴增（single-cell multiple displacement amplification，SCMDA）技術，對 33 名年齡在 11-86 歲之間、吸煙史從從不吸煙到 116 包年不等的受試者的近端支氣管基底細胞（proximal bronchial basal cells，PBBCs）進行瞭單細胞全基因組測序，研究結果發表在 Nature Genetics（IF：41.307）。

研究結果顯示，在從不吸煙者中，單核苷酸變異（single-nucleotide variants，SNV）和插入與缺失（insertions and deletions，INDEL）的頻率隨著年齡的增長而增加，吸煙者中的突變頻率顯著升高。當以吸煙年為對照時，突變跟隨癌癥風險呈線性增加，直到大約 23 包年（即每天吸煙的包數 × 吸煙年數），突變頻率趨於穩定。突變頻率的平穩可能是由於這類人群有更強大的 DNA 損傷修復系統，或解毒煙草煙霧的能力。

論文首頁截圖 圖源：Nature Genetics

下面，我們一起來看看這個研究是如何開展的。

單核的突變頻率和突變譜

為瞭描述突變特征，該研究納入瞭 33 名受試者（19 名吸煙者和 14 名從不吸煙者），並獲得瞭他們的 PBBCs。在 19 名吸煙者中，有 14 人被診斷肺癌，而隻有 1 名從不吸煙者患肺癌。研究者從冷凍的 PBBCs 顆粒中分離細胞核，並測定 3-8 個單個細胞核的突變頻率和突變譜。

從人肺中分離、處理和分析 PBBCs 的示意圖 圖源：Nature Genetics

從不吸煙者 PBBCs 中與年齡相關的突變積累

為瞭研究 PBBCs 中年齡與突變頻率的關系，研究者對來自從不吸煙者的單個 PBBC 細胞核中定量分析瞭包括單核苷酸變異（SNV）和插入與缺失（INDEL）在內的體細胞突變，並針對基因組覆蓋率和檢測敏感性進行瞭校正。

研究發現，受試者每個細胞核的 SNV 中位數在 464±108（11 歲）和 2739±778（86 歲）之間變化，相當於每年每個細胞發生 28 個突變（P = 3.9×10⁻³）。此外，研究者還發現受試者每個細胞核的 INDEL 中位數隨著年齡的增長而增加，從 59±18（11 歲）到 304±94（86 歲），相當於每年每個細胞大約發生 2 個 INDELs（P = 0.28）。

吸煙者 PBBCs 的突變頻率

接下來，研究者研究瞭吸煙者 PBBCs 中隨年齡增長的突變積累。研究結果與從不吸煙者相似，吸煙者細胞中的突變頻率隨著年齡的增長而增加，增加速率明顯更高，估計為每年每個細胞發生 91 個 SNV（P = 3.5×10⁻²），比從不吸煙者多 63 個 SNV（P = 2.1×10⁻²）。

對於 INDELs，在所有受試者中均觀察到突變頻率隨年齡的增長顯著增加（P = 4.8×10⁻²）。然而，與同齡從不吸煙者相比，44 至 81 歲吸煙者的 INDEL 頻率更高，但無統計學意義（P = 0.51）。

吸煙者 PBBCs 中的突變積累 圖源：Nature Genetics

為瞭更好地瞭解吸煙和突變負荷之間的關系，研究者分析瞭正常 PBBCs 的突變頻率與累積吸煙劑量的函數關系，吸煙劑量用自我報告的包年表示，定義為一年內每天吸煙 20 支。

研究者將突變頻率建模為包年的函數，使用瞭負二項式混合效應模型。在沒有異常值的情況下，突變頻率線性增加到 23 包年（95%CI：10-51 包年）後保持不變。結果表明，重度吸煙者（>60 包年）的 PBBCs 突變頻率不高於中度吸煙者（20.1-60 包年）（P = 0.11）。

測試突變頻率與吸煙包年之間關系的模型 圖源：Nature Genetics

對 INDEL 應用相同的方法，研究者在 23 包年發現瞭相同的變化點。在較重的吸煙者中這種劑量反應關系的喪失似乎表明，單憑累積突變並不能完全解釋肺癌風險隨包年增加而增加的原因。

除瞭年齡和包年的影響外，他們還研究瞭戒煙（戒煙年數）對突變頻率的可能影響，但戒煙對 SNV（P = 0.22）或 INDEL（P = 0.76）頻率沒有顯著影響。

A、B：INDEL 突變頻率和吸煙劑量 C、D：戒煙對突變頻率的影響

圖源：Nature Genetics

癌癥驅動基因突變

雖然體細胞突變通常是隨機的，但它們可以基於對宿主細胞的選擇性優勢而進行擴增，這一過程在癌癥研究中已有充分的報道。因此，研究者進一步分析瞭已知肺癌和泛癌驅動基因中體細胞突變的數據集。在來自吸煙者和非吸煙者的細胞核中觀察到 100656 個體細胞突變，其中，肺癌驅動基因中 21 個突變發生在 11% 的細胞核中，泛癌癥驅動基因中 111 個突變發生在 50% 的細胞核中。然而，隨機基因組的排列測試表明，肺癌（P = 0.73）或泛癌（P = 0.81）驅動基因的突變在統計學上沒有顯著富集。

正常 PBBCs 細胞核中的癌癥驅動基因突變 圖源：Nature Genetics

突變特征

接著，研究者分析瞭與衰老或吸煙相關的體細胞突變特征。吸煙者 PBBCs 中發現單堿基替換（SBS）特征的分析揭示瞭 SBS4 的存在，而從不吸煙者中幾乎不存在 SBS4。SBS4 先前已被證明是吸煙者肺癌的主要特征。盡管吸煙者中 SBS4 的突變數量顯著更高，但它與年齡無關（P = 0.40）。SBS5 引起的突變與吸煙狀態顯著相關，但與實際年齡的相關性更強。從所有受試者、吸煙者和從不吸煙者中提取的其他 14 個特征與各種分子機制相關。

變異特征和吸煙 圖源：Nature Genetics

肺癌的易感性與種系遺傳變異有關

最後，為瞭評估遺傳背景對 PBBCs 突變的可能影響，研究者測試瞭所有受試者是否存在先前與實體癌相關、並列在 Clinvar 數據庫中的種系變異。在 31 名受試者中，16 名被診斷為癌癥（14 名肺癌，1 名前列腺癌，1 名乳腺癌）。他們還發現，共有 17 人攜帶瞭與實體癌（肺癌、乳腺癌、結腸癌、肉瘤、淋巴瘤、前列腺癌）風險相關的六種已確定的基因突變中的至少一種。在這 17 名受試者中，13 名被診斷為癌癥（11 名肺癌、1 名前列腺癌和 1 名乳腺癌）。

研究者發現，兩名吸煙受試者存在 AKR1C2（編碼醛/酮還原酶）基因多態性，這對 PAHs 的解毒至關重要，而且這兩人突變負荷中的 SBS4 特征部分增加瞭 2 倍以上（P = 2.2×10−16）。這表明 AKR1C2 突變可能降低攜帶者對煙草煙霧的解毒作用，增加對吸煙誘發的致突變性的易感性。

與實體癌相關的種系遺傳變異 圖源：Nature Genetics

總結

總之，該研究對不同年齡段的吸煙者和非吸煙者進行人肺單細胞體細胞突變分析，證實瞭吸煙通過增加體細胞突變頻率增加肺癌風險的模型，通過該模型，合理的解釋瞭為什麼大多數吸煙者從未得肺癌。

另一方面，吸煙者基因突變頻率的劑量依賴性在 23 包年後趨於平穩，這表明可以通過減少突變來降低肺癌風險，例如通過提高 DNA 修復準確性或通過優化煙草煙霧的解毒來減少 DNA 損傷。

該研究為進一步評估可調節正常支氣管細胞突變易感性的、內在的肺癌危險因素的性質提供瞭合理的依據。

本文首發於丁香園旗下專業平臺：丁香園腫瘤時間

作者：貝塔_內啡肽；排版：林舒雅